Pipetty電動(dòng)移液器在尼帕病毒檢測（實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR)中的應(yīng)用

摘要：根據(jù)國家疾控中心相關(guān)的尼帕病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)方案，旨在提供Pipetty電動(dòng)移液器在尼帕病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測中的具體應(yīng)用，結(jié)合核酸提取、RT-PCR反應(yīng)體系配制、擴(kuò)增檢測等核心實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，發(fā)揮其精準(zhǔn)微量移液、高效操作、防交叉污染的優(yōu)勢，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作步驟，保障尼帕病毒核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和可靠性，為實(shí)驗(yàn)室開展尼帕病毒快速篩查與確診提供標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)支撐。

方案詳情：

一、實(shí)驗(yàn)原理

尼帕病毒屬于單股負(fù)鏈RNA病毒，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（Realtime RT-PCR）技術(shù)是檢測該病毒的核心方法，其原理是先通過反轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，利用尼帕病毒特異性上游引物、下游引物與熒光探針，在Taq酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增過程中，熒光探針與目的片段特異性結(jié)合，隨著擴(kuò)增循環(huán)的進(jìn)行，熒光信號(hào)不斷累積，通過儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光強(qiáng)度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)尼帕病毒核酸的定性判斷和定量分析。

二、?實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1、設(shè)配和材料

① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250；

② 核酸提取儀；

③ PCR擴(kuò)增儀；

④ 生物安全柜；

⑤ 水浴鍋；

⑥ 冰箱和冰柜；

⑦ 離心機(jī)。

2、試劑和材料

① 上游引物TCA-GCA-GGA-AGG-CAA-GAG-AGT-AA；

下游引物CCC-CTT-CAT-CGA-TAT-CTT-GAT-CA；

熒光探針FAM-CCT-CCA-ATG-AGC-ACA-CCT-CCT-GCA-G-TAMRA；

② RT-PCR試劑盒；

③ 陰性對(duì)照；

④ 陽性對(duì)照；

⑤ 無核酶水；

⑥ RNA提取試劑。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、將待測樣本（如血液、腦脊液、尿液等）在生物安全柜中進(jìn)行預(yù)處理。

2、反應(yīng)條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體使用的商業(yè)化 Realtime RT-PCR試劑盒為準(zhǔn)，以QIAGEN公司OneStepRT-PCR試劑盒為例。核酸擴(kuò)增檢測的反應(yīng)體系如下：

3、反應(yīng)體系

注：每次檢測均需配制陽性對(duì)照和陰性對(duì)照作為實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)控。

4、使用Pipetty電動(dòng)移液器根據(jù)預(yù)設(shè)的熒光PCR反應(yīng)體系表，設(shè)置單次分液模式；先計(jì)算所需總孔數(shù)，將除待測樣本之外的所有試劑按對(duì)應(yīng)體積計(jì)算后，額外增加10%的試劑體積，精準(zhǔn)移取至同一離心管中，開啟移液器混勻模式，將試劑自動(dòng)混勻。

5、將Pipetty電動(dòng)移液器切換至連續(xù)分液模式，根據(jù)單孔反應(yīng)體系體積，精準(zhǔn)吸取混合好的試劑，分別加入到96孔PCR板的對(duì)應(yīng)孔中。再用移液器精準(zhǔn)吸取對(duì)應(yīng)體積的待測樣本，加入到對(duì)應(yīng)孔中，將96孔板放入高速離心機(jī)，離心。

6、反應(yīng)程序設(shè)置（按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀說明書操作）：

反轉(zhuǎn)錄階段：50℃，30分鐘；95℃，15分鐘（無循環(huán)，完成反轉(zhuǎn)錄及酶激活）；

擴(kuò)增階段：95℃，30秒（變性）；55℃，30秒（退火）；72℃，60秒（延伸），讀取熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)；

擴(kuò)增結(jié)束后，儀器自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線和Ct值，用于結(jié)果判定。